ZUSCHRIFTEN
tausch aus chemisch synthetisiertem Dilithiumsalz) [12, 131 gelost. Der Ansatz wurde rnit 0.083 U (1 U = 1 p o l m i n -' ) der Dehydratase (1.45 mL Rohextrakt aus E. coii B, IS]) versetzt. rnit destilliertem Wasser auf 10 mL aufgefullt und bei 37 "C unter stetem Schiitteln inkubiert. Nach 2 d konnte im DC (2-Propanol/Ethanol/Wasser = 5:3:2, 5% HOAc, 2 % Triethylamin; Produkt R, = 0.4, Edukt R, = 0.3, dTMP R, = 0.5, dTDP R, = 0.2) keine weitere Produktbildung mehr detektiert werden. Der Ansatz wurde 30 s im siedenden Wasserbad denaturiert, auf ca. 3 mL gefriergetrocknet und an Sephadex G-10 (2 x 160 cm; 1 mLmin-I) vorfraktioniert. Die Nucleotidzucker enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, durch Ionenaustauschchromatographie (Dowex 1 x 2, CI--Form, 5 x 18 cm) gereinigt (800 mL linearer Gradient 0-0.8 M LiC1) und eingeeugt. Entsalzung an Sepbadex G-10 und anschlieOendes Lyophilisieren lieferten die Dilithiumsalze der Produkte als weiBe Schlume. Ausb. 2 und 3 (ca. 3:2 gemlO 'H-NMR-Spektrum): 26 mg (54%); Ausb. 5: 20 mg (41 YO); Ausb. 7: 23 mg (24%).
2 :
In einem 2-mL-Eppendorf-ReaktionsgefiO wurden 41 mg (60 pmol) dTDP-Glucose-Dinatriumsalz (Sigma) in 2 mL Tris/HCI-Puffer pH 7.5 (50 mM) gelost, mit 1 U rekombinanter dTDP-~-Glucose-4,5-Dehydratase (65 pL Rohextrakt, 9.5 mgmL-' Protein) versetrt und bei 37 "C inkubiert. Nach vollstandigem Umsatz (ca. 2 h) wurde der Ansatz 2 min bei 95°C denaturiert, 2 min bei 12400 x g zentrifugiert und durch eine 0.45-pm-Membran filtriert. Die Auftrennung erfolgte durch praparative HPLC (Hypersil ODs-10 p, 2 x 25 cm, Macherey Nagel, Diiren. 0.04 M NH,CO,-Losung (pH 3). 0.0038 % (v/v) Octylamin, 1 % (v/v) Methanol, isokratisch, FlieBgeschwindigkeit 20 mLmin-', Detektion 260 nm). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt und nach Verdiinnen mit bidestelliertem Wasser mit 250 mL min-' auf ein Membran-Anionenaustauscherinodul (KN107Q, Sartorius, Gottingen) gepumpt, die Sake des HPLC-Laufmittels rnit 5 mM NaCI-Losung entfernt und 2 mit 150 mM NaC1-Losung eluiert. Im Vakuum wurde bei 30 "C auf 10 mL eingeengt. an Sephadex G-10 (2.6 x 93 cm, FluOgeschwindigkeit 1 mlmin-') entsalzt und nach Lyophilisation das Dinatriumsalr des Produkts als voluminoser weiDer Feststoff erhalten. Ausb.: 24 mg (70%). Selbst Spuren von 3 lieBen sich in diesem Ansatz nicht nachweisen.