Kleine Moleküle und Proteine, die durch Lichteinwirkung schnell von einer inaktiven in eine aktive Form umgewandelt werden können, haben sich in der Biologie als äuûerst nützliche Werkzeuge erwiesen. [1] Wenn es gelänge, damit auch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu kontrollieren, könnte man mit diesem Ansatz zahlreiche Prozesse innerhalb der Zelle untersuchen, unter anderem Signaltransduktionswege, Genregulierung und Proteintransport. Bisher wurden hierzu auf chemischem Weg photolabile Gruppen in Proteine eingeführt, was sich jedoch nur dann selektiv durchführen läût, wenn hierfür eine einzige reaktive Seitenkette auf der Proteinoberfläche zugänglich ist. [2] Hier beschreiben wir, wie durch den Einsatz nichtnatürlicher Aminosäuren die Wechselwirkung des p21 ras -Proteins (Ras) mit seinem Effektor p120-GAP (GAP GTPase-aktivierendes Protein) durch Lichteinstrahlung ¹an-und ausgeschaltetª werden kann. Inaktiviertes (¹ausgeschaltetesª) Ras, bei dem Asp 38 durch den b-o-Nitrobenzylester der Asparaginsäure (Nb-Asp) ersetzt wurde, behält seine intrinsische GTPase-Aktivität, kann jedoch so lange nicht mit p120-GAP wechselwirken, bis es mit Licht der Wellenlänge 355 nm bestrahlt wird. Dieser Ansatz sollte auf alle Aminosäuren übertragbar sein, deren Seitenketten mit photolabilen Schutzgruppen blockiert werden können, dazu gehören Serin, Threonin, Glutaminsäure und Lysin. Er bietet damit die Möglichkeit, sowohl in vitro als auch in vivo Signaltransduktionswege und andere biologische Prozesse zu studieren, bei denen spezifische Proteinwechselwirkungen identifiziert werden können.
Von ras-Genen codierte Säugetierproteine spielen als Regulatoren bei verschiedenen Signaltransduktionsprozessen während des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung eine Schlüsselrolle. [3] Die Aktivität hängt von Konformationsänderungen ab, die wiederum von den gebundenen Guanin-Nucleotiden bestimmt werden: Der Ras-GTP-Komplex (Ras ´GTP) nimmt eine Konformation ein, die eine Wechselwirkung mit den Effektoren ermöglicht, während Ras im Komplex mit GDP inaktiv ist. [4] Das Verhältnis von Ras ´GTP zu Ras ´GDP wird bestimmt durch die GTPase-Aktivität des Proteins selbst sowie durch Proteine, die die Geschwindigkeit der Dissoziation von GDP aus dem Komplex (off rate) erhöhen (guanosine nucleotide release factors, GNRFs) [5] oder die die Hydrolyse von GTP beschleunigen (GAPs). [6] In dieser Eigenschaft ist p120-GAP ein negativer Regulator der Ras-Funktion; [7] p120-GAP kann ebenso als Effektor für Ras agieren und so in einigen Systemen einen positiven regulatorischen Effekt auf die Ras-Funktion ausüben. [5,8] Die Wechselwirkung von Ras und p120-GAP wurde durch den Austausch von Asp 38 gegen den photolabilen b-o-Nitrobenzylester der Asparaginsäure im Ras-Protein unterbunden, hierfür wurde die Technik des Einbaus nichtnatürlicher Aminosäuren verwendet. [9] Mutagenesestudien [10] und Strukturuntersuchungen [11] zeigten, daû die Aminosäuren 30 ± 38 (Schleife 2 oder Schalter I) [12] und 60 ± 76 (Schleife 4 oder Schalter II) [13] für die Wechselwirkung von Ras mit seinen Effektorproteinen äuûerst wichtig sind. Vor allem die Mutation von Asp 38 zu Ala verhindert die Aktivierung der GTPase-Aktivität durch p120-GAP und verringert die Fähigkeit zur Transformation von NIH-3T3-Zellen; [14] des weiteren wird die Bindung von Ras an andere Effektorproteine wie Raf [15] oder Phosphatidylinosit-3-Kinase [16] in vitro auûer Kraft gesetzt. Auûerdem zeigt die vor kurzem veröffentlichte Kristallstruktur des Ras/p120-GAP-Komplexes, [11] daû die Seitenkette von Asp 38 über ein gebundenes Wassermolekül eine Wasserstoffbrückenbindung mit Lys 949 von p120-GAP eingeht.