Zur spektrophotometrischen Bestimmung der sauren und alkalischen Phosphatasen mit o-Carboxy-phenyl-phosphat. Ein Vergleich mit der Spaltungsgeschwindigkeit anderer Substrate
✍ Scribed by Hans Brandenberger; Wolf H. Weihe
- Publisher
- John Wiley and Sons
- Year
- 1955
- Tongue
- German
- Weight
- 317 KB
- Volume
- 38
- Category
- Article
- ISSN
- 0018-019X
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✦ Synopsis
Einer der Autoren3) hat kiirzlich zusammen mit R. Hanson eine spektrophotometrische Bestimmungsmethode fiir saure und alkalische Phosphomonoesterasen ausgearbeitet. o-carboxy-phenylphosphat (I) wird in einer Beckman-Quarz-Kuvette durch zugesetztes Enzym zu SalicylsSiure (11) hydrolysiert. Da I1 bei 297 -298 mp ein stark ausgepragtes Absorptions-Maximum besitzt, wSihrend I in diesem Wellenbereich nur geringe Endabsorption zeigt, kann die Hydrolysengeschwindigkeit durch Messung der Extinktions-Erhohung z. B. bei 298 mp kontinuierlich verfolgt werden. Fur genaue Bestimmungen sol1 dabei das Spektrophotometer mit einem der kguflichen Einsatze zur Regulierung und Konstanthaltung der Kuvetten-Temperatur versehen sein. Die Vergleichskuvette enthalt den gleichen Ansatz, jedoch an Stelle der aktiven Fermentlosung Wasser oder durch Erhitzen oder Zusatz von Hemmstoffen inaktiviertes Enzym. Die nichtenzymatische Hydrolyse von I wird dadurch automatisch aus den Messergebnissen subtrahiert, und die d E-Werte sind ein direktes Mass der Ferment-AktivitBt*). Bei Dosierung mit der geeigneten Fermentmenge beanspruoht unsere Methode nicht uber 10 Min. Inkubationszeit (als Vorbereitung 10 Min. fur Pipettieren und Austemperieren). Die Extinktion wird in kurzen Abstanden (z. B. 1 Min.) abgelesen. So konnen 3 Parallelansiitze (1 Vergleich-und 3 Mess-Kuvetten) gleichzeitig ausgefuhrt werden. Die spektrophotometrische Bestimmung ist im Hinblick auf Genauigkeit allen uns bekannten Phosphatase-Bestimmungen weit uberlegen (siehe Kurve im exp. Teil). Die Tatsache, dass der Spaltungsgrad von I in beliebigen Zeitintervallen abgelesen werden kann, l) 2. Mitteilung uber Phosphatasen, 1. Mitteilung siehe 3 ) . 2, Jetzige Adresse : Laboratoires Nestle', Vevey. 3, H . Brandenberger & R. Hanson, Helv. 36, 900 (1953). 4) Ein Jahr nach dem Erscheinen unserer Arbeit ist von B . H. J . Hofstee in Arch. Biochemietry Biophysics 5 I, 139 (1954) eine Bestimmungsmethode fur Phosphatasen auf dem genau gleichen Prinzip und unter Benutzung des gleichen Substrates beschrieben worden.