A method for the preparation of pure crystalline aldolase (type A) from pupae of Drosophila melanogmter is described.
In einer fruheren Mitteilung L2] beschrieben wir die Isolierung und Reinigung der Aldolase aus DrosoPhila melanogaster sowie verschiedene ihrer Eigenschaften. Es handelt sich um eine Aldolase des Typus A (Muskelaldolase) [ 3 ] . In der Folge versuchten wir, die Reinigung zu vereinfachen und fur die Aufarbeitung grosserer Mengen Aldolase zu adaptieren. Bei den fruheren Versuchen [2] gewannen wir die Rohaldolase durch Ammoniumsulfatfraktionierung bei 2 4 " und erhielten fur die Fraktion 43-58% Ammoniumsulfatsattigung spezifische Aktivitaten von 60-80 BucHER-Einheiten pro mg Protein. Spater kamen wir auf hohere spezifische Aktivitaten, wenn wir die ganze Aufarbeitung bei Zimmertemperatur durchfuhrten. Es erwies sich dabei die Fraktion zwischen 42 und 55% Ammoniumsulfatsattigung als die spezifisch aktivste ; sie ergab ziemlich regelmassig 90-1 10 BucHER-Einheiten pro mg Protein. Wir gingen fur d e Herstellung der Rohaldolase immer von 50-60 g Puppen aus, die nicht langer als 2-3 Tage bei 2-4" aufbewahrt worden waren. Versuche, die Puppen statt im Morser zu zerreiben, in einem BWHLER-Homogenisator zu homogenisieren, fuhrten zu stark grun gefarbten Extrakten. Die daraus erhaltenen Enzympraparate zeigten graugrune Farbung und waren sehr schlecht loslich. Es ist dies vermutlich auf eine erhohte Extraktion von Tyrosinase und damit vermehrte Bildung von Melaninen zuruckzufuhren. Homogenisierung im Morser fuhrte dagegen bei gleichbleibender Totalausbeute an Aldolaseaktivitat auch rnit grossen Mengen Ausgangsmaterial zu nur wenig gefarbten, sehr gut loslichen Praparaten der Rohaldolase.
Die bei Zimmertemperatur aufgearbeitete Rohaldolase zeigte bei der anschliessenden Reinigung an DEAE-Sephadex A 50 noch einen weiteren Vorteil: Bei fruheren Versuchen [2] konnte die Hauptmenge des Enzyms, welches mit 0 , l ~ Trispuffer pH 7,4 auf die Saule aufgezogen worden war, erst mit hohermolarem Trispuffer wieder eluiert werden. Es erschien allerdings schon mit 0 , l ~ Tris eine sehr kleine, aktive Fraktion, die sich bei der Sedimentation in der Ultrazentrifuge gleich verhielt wie die Hauptfraktion. Bei dem bei Zimmertemperatur aufgearbeiteten Roh-Enzym hingegen wird die gesamte Aldolaseaktivitat bereits mit 0,1111 Trispuffer eluiert, und die Abtrennung derselben von der nachfolgenden Harnsaure ist bedeutend besser. Es wurden dabei spezifische Aktivitaten von 900-1100 BucHER-Einheiten (BE) pro mg Protein erreicht (Spitzenaktivitat 1340 BE/mg Protein = 12,2 Internationale Einheiten; 1 BE = 0,0091 Internationale Einheiten (IE)).