Bei der Reaktion von 2,4, G-TNBS mit primiiren Aminogruppen entsteht in alkalischer Losung eine gefLrbte Verbindung I , die spektralphotometrisch vermessen werden kann.
No2
I
Von Cuatrecasas [1] wurde die fur die Bestimmung von Peptiden und Aminosiiuren nach Satake [2] Verwendung findende Reaktion von 2,4,4,6-TNBS) rnit primiiren Aminogruppen benutzt, um qualitative Aussagen iiber den Verlauf von Modifizierungsreaktionen an unloslichen aminogruppenhttltigen Tragern zu machen. Newirth et al. [3] sowie Failla und Santi [4] gelang es, diese Methode zur Bestimmung von primlren Aminogruppen in urspriinglich unloslichen Triigern einzusetzen, indem sie die zu untersuchenden Materialien (poroses Glas bzw. Sepharose) solubilisierten. Robinson und Lilly [5] nutzten die Umsetzung mit 2,4,G-TNBS zu quantitativen Aussagen iiber den Silanisierungsgrad von aminoalkylsilanisiertem porosem Glas, teilten jedoch keine methodischen Einzelheiten mit. Die Solubilisierung der aminogruppenhaltigen Probe ist nicht gene-re11 anwendbar. I m Falle der Arbeit von Newirth et al. [3] fuhrt sie nach unserer Meinung zu NH,-Gehalten, die einem Mehrfachen der theoretisch moglichen Oberfliichenbedeckung entsprechen und moglicherweise auf die bereits erwiihnte Mehrfachbeschichtung zuruckzufuhren sin?. Fur die kovalente Fixierung von biologisch aktiven Molekulen ist aber gerade die genaue Kenntnis der echt gebundenen, reaktionsfiihigen funktionellen Gruppen wichtig. Es war das Ziel unserer Bemuhungen, diese Methode zur Bestimmung von Aminosaiuren in wiidrigem Milieu so zu modifizieren, daB damit eine Bestimmung der reaktionsfiihigen Aminogruppen unloslicher Triiger moglich wird. Das Prinzip unserer Methode besteht darin, daB die aminogruppenhaltige Probe mit einem bekannten UberschuB von 2,4,6-TNBS zur Reaktion gebracht wird und in einem nachfolgenden Schritt die im uberstand verbliebene, nicht verbrauchte TNBS durch Umsetzung mit einer NH,-haltigenverbindung, beispielsweise einer Aminosiiure, bestimmt wird. Die Differenz zwischen eingesetzter Menge anTNBS und nicht verbrauchter TNBS im Uberstand entspricht dann direkt dem Aminogruppengehalt der Probe. Fur die Bestimmung des NH,-Gehaltes von aminoalkylsilanisiertem Glas wandten wir die folgende Arbeitsvorschrift an :
Zu 20 mg y-APT-Glas (NH,-Gehalt 20-50 pmol/g Glas werden 1 ml 2,4,G-TNBS-Reagens ( 2 pmol 2,4,6-TNBS/ml 0,2 m Boratpuffer, pH 8,0) und 0,s ml 0,2 m Boratpuffer, pH 8,0 gegeben. Die Suspension wird bei 40°C (Wasserbad) geruhrt. Nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert bzw. filtriert. Aus dem Uberstand werden 0,9 ml entnommen und 0,I ml Valinlosung (20 pmol D, L-Valin/ml l%ige Trichloressigsaure) hinzugefugt. Man 1aBt nochmals 1 h bei 40°C reagieren und fugt dann 5 ml 0,5 n HCl hinzu. Die Extinktion kann sowohl bei 340 nm (doppelte Empfindlichkeit) als auch bei 410 nm bestimmt werden. Da 2,4,G-TNBS einem Eigenzerfall unterliegt, wurde sie in der Vergleichslosung weggelassen. I n der ersten Stufe der Bestimmung -wahrend der Reaktion des Festkorpers mit 2,4, G-TNBStritt eine GelbfLrbung der Losung wahrscheinlich infolge der Reaktion von desorbierten Silanmolekulen mit 2,4,6-TNBS auf. Will man die Menge der desorbierten Silanmolekule mit erfassen, mussen als Vergleichslosung 0,9 ml aus dem gefiirbten Uberstand nach der ersten Stufe der Umsetzung,